常规rna测序方法 用qPCR验证RNA-Seq挑多少个基因合适？
RNA-Seq测序后，经常用QPCR来验证结果。
因为RNA-Seq测序数据得到的结果作为定量参考，参数的变化也会造成不同的结果。所以需要QCPR验证，表达水平的结果最终以实时定量qPCR为准。一般需要验证的基因数量在20个左右。在验证过程中，RNA-Seq测序和QPCR的结果往往不一致，这是正常现象。原因可以在我们之前分享的文章中找到(戳这里)。事实上，我们看到的很多SCI都有验证实验，文章里的结果其实很不错！很多同学心里比较着急。为什么我的成绩没有达到预期？为什么我的成绩跌得这么惨？！其实也许是作者验证了几个基因，选出了10个效果不错的基因。其他验证结果不佳、与预期结果不符或自身无法解释清楚的基因，建议不要在文章中呈现。所以通常是几个，比如10个，在文章中阐述。验证多少基因，要看要发表的杂志的水平和要求。大概验证20篇一般文章就够了。在RNA-Seq实验中，如果重复样本之间的相关系数很高，那么只需要验证你关心的基因。下面我们列举一些文献中QCPR验证的RNA-Seq截图，包括Mrna、miRNA、Lnc-RNA。不难看出，很多基因QCPR的结果与
BSR序列是基于贝叶斯方法来计算SNP标记和目标基因之间的重组概率。该方法适用于资金较少、群体数据较好的实验室定位目的基因。由于使用了混合RNA测序，可以大大降低成本，同时可以获得更好的定位效果。此外，还可以分析基因表达。
材料的混合会导致差异基因的减少。如果不同表型的亲本之间候选基因的差异是由表达差异引起的，
非编码RNA是指能从DNA转录，但不能翻译成蛋白质的RNA。非编码RNA序列包括核糖体RNA、转运RNA、microRNA RNA(长非编码RNA、胞外RNA (exRNA)等多种类型[1]。
(来源:)
那么如何确定一个RNA分子是非编码RNA呢？
(1)如果已知该RNA分子的id(基因ID或转录ID(Transc))。Rapid)，可以直接在基因组注释文件中为它查找注释，从而判断它是否属于非编码RNA。
基因组注释是利用生物信息学的方法和工具对基因组中所有基因的生物功能进行高通量注释[2]。基因组注释文件可以从能够检索基因组学信息的基因组学项目网站下载，如GENCODE()、ENSEMBL()等。在 "。gtf "or "。gff "从上述网站下载，如果要搜索的RNA分子的基因ID对应的注释文件标有 "线粒体trna和rrna，lincrna "，它是非编码RNA。
(2)如果该RNA分子的基因ID或转录本ID未知，但其序列信息已知，则可通过比较方法如Blast将该RNA序列与已知基因组的序列进行比较，并可找到该序列在基因组中的位置:
如果比对结果落在基因组的注释位置，则可以直接获取该序列的基因ID和基因组文件的注释信息，步骤同(1)。
如果比较结果落在注释的位置，则可以通过计算生物学软件计算出该序列的翻译能力。如果翻译能力小，说明RNA分子几乎不可能翻译成蛋白质，符合非编码RNA的定义。可以计算序列非编码能力的软件有COME()、CPC()等。
(3)如果这个RNA分子的序列信息未知，可以通过实验方法进行扩增测序，得到它的序列信息，然后步骤同(2)。
参考
[1] Mattick，J.S .和I.V. Makunin，非编码RNA。哼莫热内特，2006年。15规格编号第R17-29页。
[2]基因组笔记/7252093？弗拉丁
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