pcr为什么要两种引物 PCR引物设计时有哪些注意事项？
PCR引物设计时有哪些注意事项？
引物设计参数：a引物长度一般在20bp左右，上下游引物碱基长度不要相差超过4个碱基。b引物退火温度一般在58度，不同软件TM使用不同的算法，primer3，primer5，primer6，primerexpress等一般可以设置在55-58度，beacondesign可以设置在65左右。cGC含量一般没什么特殊要求，40-60最好，如果不好设计，30-80也是可以的。d产物长度在100-150，80-200也可以，不要在50bp左右，那样和引物二聚体不易区分，超过200bp可能会影响PCR扩增效率。e软件给出的引物不能有发卡结构和超过3-4个碱基的匹配，特别是3`端不能有碱基匹配，那样更容易形成二聚体。f引物设计好以后，在NCBI上做一个primer-blast，检测一下是否有非特异性扩增。
pcr引物设计详细步骤？
引物设计的详细步骤
一、引物设计step by step 1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的rigin中，Cpy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。 2、
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做RT-PCR设计引物时，找引物序列有哪些好方法？
引物可以通过一些软件设计，比如primer 5 ，但是还需要注意一些细节问题。比如1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。2.引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G C） 2（A T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
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