pcr引物设计详细步骤 做RT-PCR设计引物时，找引物序列有哪些好方法？

做RT-PCR设计引物时，找引物序列有哪些好方法？

引物可以通过一些软件设计，比如primer 5 ，但是还需要注意一些细节问题。比如1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。2.引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G C） 2（A T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

怎样根据mRNA设计引物？

mRNA序列和cDNA序列基本一致，只是T、U的对应。引物设计是根据cDNA的两端序列，上游引物与cDNA的5‘端相同，下游引物与cDNA的3’反向互补序列相同，即与cDNA的互补序列的5‘端相同。cDNA的序列你在pubmed的网站可以找到（CDs那一项）。具体几个碱基，一般是15~18个就差不多了，尽量保证上下游引物的GC含量一致。这样PCR的时候，引物结合的效率是一致的，PCR成功的几率更高。另外，如果要做克隆质粒的实验，当然需要加入酶切序列啦！酶切位点的选择也有几点要注意的，你需要的话我再详细说啊！

如何进行引物设计？

如果这一对通用引物没有信号，说明你这个菌在这两个位置有snp，导致扩增不出来。几个方法可以参考一下。

1:你们大概知道这个菌的种属，那么就去ncbi上找近缘物种的16s序列，做序列比对，设计简并引物，扩增出全长，测序。

2:你们完全不知道种属，上网多找几对通用引物，最好是扩增V3V4区或者V4区的，扩增出部分再去测序比对，一般能确认属，再按照1的方法做。

3:在方法2能扩增部分序列但是设计全长引物扩增失败的情况下，利用得到的部分序列做race。

4:前面全部失败，提取DNA做2代测序，直接测基因组（如果觉得成本太高，可以少测点数据量，够比较就可以了）。

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