引物设计的六大原则 设计引物的主要依据？
设计引物的主要依据？
底漆设计有三个基本原则：
底漆和模板的顺序应紧密互补。
底漆之间应避免稳定的二聚体或发夹结构。
第三，引物不能在模板的非靶点引发DNA聚合（即错配）。
引物设计原则？
1. 引物长度一般为15-30bp，常用引物长度为18-27bp，但不超过38bp。引物GC含量一般为40%～60%，以45%～55%为宜，上下游引物GC含量和TM值应相近。引物对应的模板序列的TM值应在72℃左右，至少55～80℃，TM值曲线应在72℃左右，5〃～5〃4。Δg值（自由能）反映了底漆-模板结合的强度。3”端的Δg值较低，绝对值不应超过9，否则不利于反应的正确起始。当3′端双链的Δg值为0～2kcal/mol时，PCR产率接近100%，但在-6时仅为40%，在-8、-5时小于20%。失配率不应超过100，否则会出现非目标波段。然而，对于某些特定的模板序列，我们也应该比较它们在正确位置的启动效率。如果两者相差较大，如正确位点的起始效率大于340，而错误位点的起始效率为110，很难找到其他更合适的引物，则这对引物是可以接受的；6。FRQ曲线是oligo6软件引入的一个新指标，它解释了序列片段的重复概率，在选择引物7时应使用FRQ值。引物二聚体和发夹结构的能量绝对值不应超过4.5，否则容易产生引物二聚体，降低引物浓度，导致PCR异常。“3”的结尾不应该是连续的碱基，GGG或CCC会导致错误启动，3“的最后一个碱基不应该是a或T，如果是，则会导致不匹配；9。退火温度由公式TM=4*（G C）2*（a T）-5计算。选择TM值较低的引物的退火温度作为反应的退火温度，各引物的TM值最佳匹配，在70～75℃范围内。模板与稳定性较差的引物的TM差异越小，PCR效率越高。如果产品预期长度等于或小于500bp，则应选择末端引物（16-18bp）；如果产品长度为5kb，则应使用引物（24bp）；11。在DNA测序和PCR中，最好使用5”稳定端（GC含量较多）和3”不稳定端（at含量较多）的引物，可以有效地消除假起始反应。引物与产品的TM值相差过大，最佳温度为20℃。13底漆改性通常在5”端部进行，如添加限制性部位，同时根据需要添加保护基。
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