pcr为什么要两种引物 做RT-PCR设计引物时，找引物序列有哪些好方法？

做RT-PCR设计引物时，找引物序列有哪些好方法？

引物可以由一些软件设计，如primer 5，但需要注意一些细节。例如，1。引物应设计在模板cDNA的保守区。DNA序列的保守区是通过比较物种间的相似序列来确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（如dnaman）比对，每个基因的同一序列为该基因的保守区。2引物的长度一般在15到30碱基之间。引物长度一般为18～27bp，但不宜超过38，因为延伸温度大于74℃，不适合taqdna聚合酶反应。三。引物的GC含量在40%～60%之间，TM值应接近72℃。GC含量过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不宜相差太大。另外，上下游引物的TM值（熔化温度）是寡核苷酸的断链温度，即50%双链寡核苷酸在一定盐浓度下的温度。有效启动温度一般比TM值高5～10℃。按公式TM=4（gc）2（at）估算引物TM值时，有效引物TM值为55～80℃，最佳复性条件下，有效引物TM值应接近72℃。

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