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pcr为什么要两种引物 做RT-PCR设计引物时,找引物序列有哪些好方法?

浏览量:2624 时间:2021-03-22 14:28:54 作者:admin

做RT-PCR设计引物时,找引物序列有哪些好方法?

引物可以由一些软件设计,如primer 5,但需要注意一些细节。例如,1。引物应设计在模板cDNA的保守区。DNA序列的保守区是通过比较物种间的相似序列来确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因,通过序列分析软件(如dnaman)比对,每个基因的同一序列为该基因的保守区。2引物的长度一般在15到30碱基之间。引物长度一般为18~27bp,但不宜超过38,因为延伸温度大于74℃,不适合taqdna聚合酶反应。三。引物的GC含量在40%~60%之间,TM值应接近72℃。GC含量过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不宜相差太大。另外,上下游引物的TM值(熔化温度)是寡核苷酸的断链温度,即50%双链寡核苷酸在一定盐浓度下的温度。有效启动温度一般比TM值高5~10℃。按公式TM=4(gc)2(at)估算引物TM值时,有效引物TM值为55~80℃,最佳复性条件下,有效引物TM值应接近72℃。

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