简并引物设计 自学设计有哪些好用的网站？
自学设计有哪些好用的网站？
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如何进行引物设计？
如果这对通用引物没有信号，说明这两个位置有SNP，导致没有扩增。可以参考几种方法。
1：你可能知道这种细菌的种类和属，所以去NCBI找到相关种类的16S序列，做序列比对，设计简并引物，扩增全长，然后测序。
2：你根本不了解物种。你可以在网上找到更多的入门知识。最好放大v3v4区或V4区。在放大了其中一些之后，你可以对它们进行排序和比较。一般来说，你可以确认属，然后按照1的方法。
3:如果部分序列可以通过方法2扩增，但全长引物未能扩增，则将获得的部分序列用作race。
4:以上所有操作均失败。第二代的DNA被提取和测序，基因组被直接测量（如果你认为成本太高，你可以减少数据量进行比较）。
做RT-PCR设计引物时，找引物序列有哪些好方法？
引物可以由一些软件设计，如primer 5，但需要注意一些细节。例如，1。引物应设计在模板cDNA的保守区。DNA序列的保守区是通过比较物种间的相似序列来确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（如dnaman）比对，每个基因的同一序列为该基因的保守区。2引物的长度一般在15到30碱基之间。引物长度一般为18～27bp，但不宜超过38，因为延伸温度大于74℃，不适合taqdna聚合酶反应。三。引物的GC含量在40%～60%之间，TM值应接近72℃。GC含量过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不宜相差太大。另外，上下游引物的TM值（熔化温度）是寡核苷酸的断链温度，即50%双链寡核苷酸在一定盐浓度下的温度。有效启动温度一般比TM值高5～10℃。按公式TM=4（gc）2（at）估算引物TM值时，有效引物TM值为55～80℃，最佳复性条件下，有效引物TM值应接近72℃。
怎样选择合适的引物？
在PubMed网站上找到相应基因的mRNA序列，复制到引物设计软件（如primer premier），软件会设计不同的正、负链引物，选择合适的一个（得分较高），复制到PubMed网站，下拉框中有PubMed blast，粘贴软件设计的前、后引物，通过搜索结果判断引物是否正确、特异。
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